El diagnóstico de las manifestaciones tardías de la enfermedad de Lyme se lleva a cabo a partir de la historia incluyendo datos epidemiológicos y síntomas y signos de una infección precoz y a partir de pruebas serológicas específicas e histología de biopsias de la piel. Ocasionalmente puede identificarse la B. burgdorferi por cultivo de las espiroquetas o por PCR, por ejemplo, en el fluido articular. La infección se confirma mediante la detección de anticuerpos por ELISA o por la prueba de fluorescencia indirecta (IFA) con una confirmación con un estudio de hibridación (Western blot). Todos los pacientes con borreliosis de Lyme son seropositivos para la inmunoglobulina G y algunos también lo son para la IgG antiborrelial.

Pueden producirse falsos positivos por interferencia del Treponema pallidum y otras espiroquetas, así como en pacientes con mononucleosis infecciosa o con otras enfermedades que cursan con activación de células B