PRUEBAS
REACCION DE LA POLIMERASA EN CADENA (PCR)
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La reacción de la polimerasa en cadena es una técnica de biología molecular que permite amplificar muchas veces un fragmento de ADN. De esta manera, se puede disponer a partir de una sola copia de un fragmento de ADN una cantidad suficiente del mismo como para poder ser sometido a una serie de análisis que permitan su identificación. Esta técnica se base en las propiedades que tiene el ADN de doble cadena y en una enzima, la polimerasa. Como se sabe, el ADN es una doble cadena formada por cuatro unidades -- los nucleótidos -- que se enfrentan en la cadena de dos (se dice que son complementarios ) de manera que la citidina (C) tiene tendencia a acoplarse a la guanina (G) y la adenina (A) a la timidina (T). Cuando se calienta a 94-96º las dos cadenas del ADN se separan sin romperse (este proceso se denomina desnaturalizacion). Cuando se enfría, las dos hebras de ADN tienden a reagruparse formando puentes de hidrógeno entre nucleótidos complementarios Supongamos que disponemos de un fragmento de ADN, procedente de un virus o de una huella digital que queremos amplificar para analizarlo (este fragmento puede tener varios miles de nuclétidos). Este trozo de ADN se añade a un medio de reacción que contiene los cuatro nucleótidos A,C,G,T, una enzima que es capaz de unir dichos nucleótidos uno a uno (la polimerasa) y unos oligonucleotidos (denominados cebadores o primers que sabemos que son complementarios del ADN desconocido) que se sintetizan por medios químicos y que suelen tener entre 15 y 20 nucléotidos. Además, el medio de raección contienen magnesio y otros cationes y una solución tampón para mantener un pH adecuado Al calentar a 94º, las dos hebras del ADN inicial se separan. Si se enfría el medio de reacción a 54º durante un corto tiempo en lugar de unirse las dos hebras enteras, se unen a cada una de ellas los cebadores o primers (este primer paso se denomina hibridación). La pregunta que puede hacerse el lector es ¿porqué se hibridan los cebadores y no se unen las dos moléculas de ADN iniciales?. La respuesta es: es cuestión simplemente de probabilidades: del ADN original hay solo trazas (incluso puede haber una única copia) mientras que hemos añadido una cantidad enorme en comparación de los cebadores) Al calentar a 74ºC, la polimerasa va añadiendo a cada una de las hebras a las que se han hibridado los cebadores los nucleótidos complementarios de los existentes en cada hebra (es decir cada hebra actúa como un molde para que la polimerasa sepa que nucleótidos debe añadir). Como la polimerasa solo añade nucléotidos en una sola dirección (3' --> 5') uniendo los grupos fosfatos, se van añadiendo a cada una de las hebras los nucléotidos necesarios para formar una nueva doble cadena. La polimerasa añade 1000 nucleótidos/minuto Es esta manera, resultan dos cadenas dobles de ADN idénticas a la inicial. El segundo ciclo es idéntico al primero: calentamiento a 94º para desnaturalizar, enfriado a 54º para hibridar los cebadores y calentamiento a 74º C para que la polimerasa añada los nucleótidos. En el segundo ciclo se producen 4 cadenas, 8 en el tercero.... y así de forma exponencial va aumentando el número de copias del ADN inicial Una vez terminado el proceso de amplificación, se cuando se dispone de una cantidad de ADN suficiente, se le somete al análisis deseado, generalmente una electroforesis sobre gel de agarosa que separa por tamaños los fragmentos de ADN procedentes de la PCR. La electroforesis resultante se compara entonces con la electroforesis del ADN de referencia (p.ej. si el ADN es de un niño, se compara con el de los padres) La PCR se utiliza rutinariamente en la obtención de la huella genética, test de Paternidad, diagnóstico de enfermedades hereditarias, identificación de virus, clonación de genes, mutagénesis, análisis de ADN fósil o procedente de momias, genotipado de mutaciones específicas, identificación de especies y tipaje HLA
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REFERENCIAS
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| Monografia creada el 18 de Enero de 2008. |
